Abstract
Durante un monitoraggio sanitario di routine ad Alligator Creek, nel sud-est di Townsville (Australia) sono state osservate lesioni cutanee in una popolazione selvatica di tartarughe d’acqua dolce. I tentativi precedenti di identificare l’agente causale di queste lesioni sono stati fallimentari; comunque, elementi di prova esistenti suggeriscono un’eziologia virale.
Per investigare meglio questi casi, i campioni di sangue e delle lesioni e i tamponi orali e cloacali raccolti da 128 esemplari di due siti differenti (Alligator Creek e Ross River) sono stati testati per herpesvirus, adenovirus, poxvirus e papillomavirus tramite reazione a catena della polimerasi (PCR). Sono stati individuati 3 nuovi herpesvirus (Chelid herpesvirus 1-3) così come tre nuovi adenovirus (Saw-shelled turtle adenovirus 1-3). Analisi filogenetiche mostrano che questi herpesvirus formano un nuovo clade all’interno della sottofamiglia Alphaherpesvirinae insieme con il tumour-associated Chelonid alphaherpesvirus 5 (Scutavirus chelonidalpha5). Gli adenovirus invece rientrano come membri del genere Testadenovirus.
Sebbene i nuovi herpesvirus ed adenovirus non possono essere associati all’insorgenza delle lesioni cutanee, ulteriori caratterizzazioni aiuteranno a fornire migliori approfondimenti nel loro significato clinico, epidemiologico e di conservazione.
Introduzione
L’Australia è la casa di diverse tartarughe d’acqua dolce della famiglia Chelidae che contiene almeno 20 specie endemiche. La maggior parte delle tartarughe d’acqua dolce australiane, incluse la tartaruga a guscio di sega (Myuchelys latisternum) e la tartaruga di Krefft (Emydura macquarii krefftii), appartengono al sottordine Pleurodira, e sono evolutivamente e geneticamente distinte dalle tartarughe del sottordine Cryptodira. Le tartarughe d’acqua dolce australiane comprendono due forme morfologiche, ovvero le tartarughe a collo corto e quelle a collo lungo, che sono entrambe distribuite ampiamente nel paese. Sono specie altamente acquatiche e principalmente lasciano l’acqua per deporre le uova, esporsi al sole, oppure migrare tra bacini d’acqua in cerca di un partner o di cibo.
Le tartarughe acquatiche sono longeve e ben adattare a diverse strategie di foraggiamento, tra cui scavare per cercare il cibo, opportunismo, erbivorismo e carnivorismo. In questo modo, giocano un ruolo vitale nel mantenimento ecologico della diversità e fungono come un importante indicatore di salute ambientale. Molte delle tartarughe d’acqua dolce australiane sono classificate dalle agenzie di conservazione come vulnerabili, minacciate o criticamente minacciate. La sopravvivenza di queste tartarughe è costantemente minacciata da diversi fattori, incluse le attività umane, i disastri naturali e le epidemie di malattie. Le infezioni virali possono potenzialmente minacciare l’estinzione di tartarughe d’acqua dolce in bacini idrologici locali, come dimostrato nella popolazione di tartarughe azzannatrici di Bellinger River (Myuchelys georgensi) nel 2015. (Cann et al. 2015; Spencer et al. 2018; Zhang et al. 2018; Van Dyke et al. 2019).
In maniera simile, un nuovo Turtle fraservirus 1 (TFV1) e il Soft-shelled turtle systemic septicaemia spherical virus (STSSSV) sono stati riportati come causa di importanti eventi di mortalità in popolazioni di tartarughe d’acqua dolce in USA e Cina rispettivamente. (Chen et al. 2017; Lyu et al. 2019; Waltzek et al. 2022). Quindi, è diventato importante monitorare la salute delle popolazioni minacciate per il rilevamento per tempo e la possibile prevenzione di nuove o emergenti malattie virali. Gli herpesvirus e gli adenovirus sono importanti patogeni dei cheloni e sono stati implicati in varie malattie cliniche sia con patogeni che con fattori non infettivi (stress o immunosoppressione), considerati come fattori contribuenti nella maggior parte dei casi. Gli herpesvirus sono stati anche identificati in cheloni clinicamente sani grazie alla loro abilità di rimanere latenti in ospiti suscettibili ma comunque, possono causare malattie severe quando si riattivano in alcuni ospiti o quando il virus infetta specie strettamente correlate. Sono stati associati a stomatiti, glossiti e riniti necrotiche e necrotizzanti nelle testuggini; lesioni proliferative e/o ulcerative nelle tartarughe d’acqua dolce e fibropapillomatosi e grey-patch disease nelle tartarughe marine.
Gli adenovirus che infettano i cheloni includono membri del genere Siadenovirus, Atadenovirus e Testadenovirus. Mentre Siadenovirus (Sulawesi tortoise adenovirus 1) e Atadenovirus (Spur-thighed tortoise adenovirus 1) sono stati associati ad anoressia, letargia, ulcerazione ed erosione della mucosa orale, stomatiti, esofagiti e mortalità nelle testuggini, i Testadenovirus sono stati frequentemente trovati in cheloni clinicamente sani. Durante un monitoraggio e controllo di routine di tartarughe acquatiche selvatiche ad Alligator Creek, North Queensland nel 2016, su un grande numero di esemplari furono osservate lesioni cutanee. Fu quindi condotta una ricerca per individuare gli agenti causali dalle lesioni campionate. Sebbene un agente specifico non fu individuato, le caratteristiche patologiche delle lesioni cutanee sembravano essere coerenti con lesioni precedentemente descritte in tartarughe ed altri rettili associate ad agenti virali (come primari o copatogeni) inclusi herpesvirus, adenovirus, papillomavirus, ranavirus, reovirus e poxvirus.
Questo studio ha ulteriormente valutato lo stato di salute della popolazione di tartarughe acquatiche di Alligator Creek per determinare l’occorrenza e l’associazione di alcuni di questi sospetti patogeni virali con le lesioni cutanee.
Materiali e metodi
Il campionamento delle tartarughe è stato condotto ad Alligator Creek, 25km a sud della città di Townsville, Queensland (Australia). Il bacino che è stato campionato vede la presenza di due specie di tartarughe acquatiche di acqua dolce, Emydura macquarii krefftii e Myuchelys latisternum così come altre specie di acqua dolce tra pesci, crostacei e coccodrilli. I campioni sono stati raccolti anche da Ross River, Townsville, che dista 20km da Alligator Creek, su uno spartiacque diverso. In questi bacini ci sono le stesse specie ma gli esemplari di Ross River non presentano lesioni cutanee, sono quindi stati campionati come gruppo di controllo. Questo permette di valutare se esiste una correlazione statistica tra virus e lesioni.
Raccolta dei campioni ed estrazione del DNA
Le tartarughe sono state catturate a mano durante lo snorkeling e diversi campioni sono stati raccolti da 28 esemplari di Emydura macquarii krefftii e 29 Myuchelys latisternum. Altri campioni sono poi stati raccolti dagli esemplari di Ross River (67 Emydura macquarii krefftii e 4 Myuchelys latisternum). A scopo di identificazione e monitoraggio della malattia, tutti gli esemplari catturati sono stati marcati con una targhetta in titanio applicata su una delle zampe anteriori. Su tutti gli esemplari sono stati poi raccolti i dati morfometrici e tamponi della mucosa orale e cloacale. In seguito, dopo aver pulito e disinfettato le lesioni cutanee, vi sono stati raccolti campioni di tessuto ed effettuati tamponi utilizzando materiale sterile. Infine, sono stati raccolti campioni di sangue dalla vena giugulare.
Tutti i campioni sono stati trasportati refrigerati al laboratorio e poi conservati a -80°C. Il sangue prima di essere congelato è stato centrifugato (nonostante si fosse già sedimentato in campo), e sono stati separati siero e parte corpuscolata. Inizialmente i campioni sono stati raccolti in pool sulla base del tipo di campione, specie e luogo di prelievo, per un iniziale screening. L’estrazione del DNA è stata poi eseguita sia sui campioni individuali che sui pool. Sia i pool che i campioni individuali sono stati testati tramite PCR per la ricerca di herpesvirus, adenovirus, poxvirus, papillomavirus.
Risultati
Tra agosto e maggio 2021, un totale di 311 campioni è stato raccolto da 128 tartarughe d’acqua dolce ad Alligator Creek e Ross River, Townsville. Questi campioni sono stati testati sia individualmente che in pool. Complessivamente, tre pool, una lesione, 18 tamponi orali e 28 tamponi cloacali da 39 delle 128 tartarughe analizzate erano positivi al nuovo herpesvirus. I risultati positivi sono stati ottenuti da 28 delle 95 Emydura macquarii krefftii e da 11 delle 33 Myuchelys latisternum catturate. In Alligator Creek, 7 delle 29 Myuchelys latisternum erano positive per herpesvirus, mentre nessuna delle Emydura macquarii krefftii è risultata positiva. Da Ross River, tutte le Myuchelys latisternum (4/4) e 28 delle 67 Emydura macquarii krefftii sono risultate positive per herpesvirus.
Le lesioni cutanee sono state viste su 20 tartarughe (7 Emydura macquarii krefftii e 13 Myuchelys latisternum) catturate ad Alligator Creek. Tre pool di campioni dalle Myuchelys latisternum e dalle Emydura macquarii krefftii erano positivi ad adenovirus, ma nessun test è stato fatto per cercare l’adenovirus in campioni individuali. L’uso di indagini statistiche ha permesso di rilevare che non c’è un’associazione tra l’infezione da herpesvirus e le lesioni cutanee nelle tartarughe d’acqua dolce ad Alligator Creek. L’analisi genetica dei virus rilevati ha portato alla scoperta di tre nuovi herpesvirus e tre nuovi adenovirus. I nuovi herpesvirus rientrano nella famiglia Alphaherpesvirinae e sono raggruppati più vicino con il Chelonid herpesvirus 5 (associato a tumori cutanei nelle tartarughe marine). Questi sono stati per ora nominati come Chelid herpesvirus 1, 2 e 3. Il ChelHV2 è stato trovato nei tamponi orali e cloacali di 22 tartarughe (2 Myuchelys latisternum e 20 Emydura macquarii krefftii), mentre il ChelHV3 è stato trovato nelle lesioni e nei tamponi orali e cloacali di 6 Myuchelys latisternum. Per il ChelHV1 non è stato possibile associarlo ad altri campioni. I nuovi adenovirus rientrano nel genere Testadenovirus e sono stati momentaneamente chiamati Saw-shelled turtle adenovirus 1, 2 e 3 (SsTAdV).
Discussione
L’identificazione di nuovi virus (herpesvirus e adenovirus) in tartarughe d’acqua dolce australiane selvatiche è importante per capire potenziali trattamenti così come per il monitoraggio di malattie emergenti. In questo studio, tre nuovi herpesvirus sono stati individuati in tartarughe sane così come in tartarughe con lesioni cutanee (e senza altri segni clinici rilevabili) tramite l’utilizzo della PCR. Diversi tentativi di identificare herpesvirus in tartarughe d’acqua dolce australiane da ricercatori precedenti sono stati fallimentari. Per esempio, Cowan et al hanno ottenuto ampliconi PCR positivi per herpesvirus e dimostrato la presenza di corpi inclusi intranucleari eosinofilici nelle lesioni cutanee di una Emydura macquarii krefftii in cattività, ma non sono stati in grado di sequenzialo. Per quanto ne sappiamo, le scoperte dello studio rappresentano la prima identificazione e parziale caratterizzazione di herpesvirus in qualsiasi specie di tartarughe d’acqua dolce australiana.
È interessante che i nuovi herpesvirus identificati formano un nuovo lineaggio con il ChHV5 che è associato alla formazione di tumori, in particolar modo a lesioni fibropapillomatose nelle tartarughe marine. I ChelHVs formano un gruppo anche con altri herpesvirus delle tartarughe, alcuni dei quali sono associati a lesioni cutanee. Ad esempio, Emydoidea herpesvirus 2 e Terrapene herpesvirus 1, sono stati associati rispettivamente a carcinoma a cellule squamose (in Emydoidea blandigii) e fibropapillomatosi (in Terrapene carolina). Specie virali strettamente correlate facilmente condividono tratti patogenetici ed epidemiologici, questo implica che i chelid herpesvirus sono un potenziale fattore contribuente alle lesioni cutanee viste in questo studio. Comunque, si è visto che non c’è correlazione statistica tra le lesioni cutanee e questi nuovi herpesvirus, suggerendo che probabilmente sono patogeni adattati all’ospite e potrebbero non essere collegati alla presentazione della malattia. Studi precedenti hanno individuato herpesvirus in soggetti sani, il che indica ulteriormente che gli herpesvirus possono causare infezioni subcliniche o latenti in ospiti adattativi. Questa infezione potrebbe però causare una severa malattia in specie affini, è quindi necessario investigare ulteriormente le implicazioni di questi nuovi herpesvirus sulla salute delle tartarughe d’acqua dolce.
Tutti gli herpesvirus dei rettili geneticamente caratterizzati ad oggi sono raggruppati nella sottofamiglia Alphaherpesvirinae. Anche i ChelHVs rientrano in questa famiglia e formano un gruppo distinto con il ChHV5. La marcata variazione del lineaggio dei ChelHVs dagli altri herpesvirus delle tartarughe d’acqua dolce non è chiaramente compresa. Si può ipotizzare che sia perché i virus sono conosciuti per coevolvere con i loro ospiti e la maggior parte degli herpesvirus precedentemente identificati nelle tartarughe d’acqua dolce sono di specie del sottordine Cryptodira, che sono geneticamente ed evolutivamente diverse dalle specie australiane che sono nel sottordine Pleurodira, e questo potrebbe aver influenzato la variazione del lineaggio. Comunque, per caratterizzare meglio questi nuovi herpesvirus si necessita di sequenze genetiche complete, che non è stato possibile ottenere in questo studio.
Gli herpesvirus possono causare malattie severe quando infettano popolazioni di rettili naïve, giovani o immuno-compromesse. Perciò, una buona conoscenza dell’epidemiologia degli herpesvirus può aiutare nella prevenzione e nel controllo di focolai di malattia nelle popolazioni selvatiche e domestiche. Non si può chiaramente dividere le specie individuali di ChelHV in base alla loro preferenza di ospite e localizzazione; ma, i risultati preliminari suggeriscono che il ChelH-3 è ospite specifico e infetta prevalentemente le Myuchelys latisternum. Il ChelHV-1 e 2 sono stati trovati maggiormente nei campioni da Ross River. Complessivamente, una prevalenza del 30% è stata registrata per i ChelHVs in due popolazioni di tartarughe d’acqua dolce selvatiche. Con tassi di prevalenza leggermente maggiore per le Myuchelys latisternum (33%) che per le Emydura macquarii krefftii (29%). La prevalenza di herpesvirus osservata in questo studio è simile a quella riportata per il Terrapene herpesvirus 1 in Terrapene carolina selvatiche negli USA (31,3%), ma minore della prevalenza del 40% e 51,5% riportata rispettivamente in Terrapene carolina in cattività e Glyptemys muhlenbergii selvatiche. Ricerche future dovranno focalizzarsi sulla caratterizzazione dell’epidemiologia degli herpesvirus nelle tartarughe d’acqua dolce australiane per fornire una migliore conoscenza e importanza di questi virus sulla salute complessiva dei loro ospiti.
Gli adenovirus sono stati trovati in tante specie di rettili e più comunemente infettano diverse specie di lucertole. Questi virus sono distribuiti in tutto il mondo, e le infezioni sono caratterizzate da anoressia, che può portare a letargia e deperimento. Altri segni clinici riportati sono diarrea, rinorrea, complicazioni neurologiche, stomatiti, dermatiti e morte improvvisa. Nei cheloni, gli adenovirus sono associati con severe malattie sistemiche, biliverdinuria, deperimento, emorragie severe e mortalità; sebbene alcune infezioni siano asintomatiche. Generalmente, la patogenicità degli adenovirus e la loro abilità di causare patologie primarie sono ancora da chiarire dato che molti casi clinici di infezione da adenovirus nei cheloni sono stati associati con diversi cofattori come coinfezioni, stress ed immunosoppressione. In questo studio, tre nuove specie di adenovirus (SsTAdV 1-3) sono state trovate in due popolazioni di tartarughe d’acqua dolce. Alcune tartarughe in queste popolazioni avevano lesioni cutanee caratterizzate da foci irregolari, contratti e biancastri sulla superficie dorsale di coda, gambe e collo. I dati ottenuti in questo studio non associano questi adenovirus come agenti causali delle lesioni cutanee. Questo rilievo è tipico dei membri del genere Testadenovirus, che finora non sono stati associati a malattie cliniche. Comunque, il caso di nuovi adenovirus in questa popolazione di tartarughe d’acqua dolce non deve essere ignorato dato che gli adenovirus possono potenzialmente causare malattie che minacciano la conservazione. Quindi, c’è bisogno di sostenere una sorveglianza sanitaria in questa popolazione di tartarughe e caratterizzare meglio i nuovi virus per accertare la loro patogenicità.
Papillomavirus e poxvirus non sono stati trovati in nessuna lesione testata in questo studio. Studi precedenti hanno identificato questi virus come agenti causali di varie lesioni cutanee nei rettili. Anche coinfezioni di questi virus con altri patogeni come gli herpesvirus potrebbe formare la relazione causale che va ad esacerbare la presentazione della malattia. Comunque, è possibile che la limitata sensibilità dell’analisi abbia portato ad una mancata diagnosi. Comunque, lo stato di salute di questa popolazione di tartarughe deve essere continuamente aggiornato per la presenza di potenziali virus patogeni allo sviluppare di nuovi e migliorati test.
Conclusioni
La scoperta di nuovi virus nelle specie selvatiche è essenziale nel fornire approfondimenti e identificare potenziali fattori di rischio di importanza conservazionistica. Gli herpesvirus e gli adenovirus sono patogeni clinicamente importanti per le specie selvatiche, sebbene l’ecologia della malattia in alcune specie inclusi i rettili rimane incerta. In questo studio, sono stati identificati e caratterizzati sei nuovi herpesvirus e adenovirus in due specie di tartarughe d’acqua dolce australiane. Una sorveglianza di routine e una migliore caratterizzazione di questi nuovi virus potrebbe aiutare nel fornire migliori approfondimenti nel loro significato epidemiologico e di conservazione.
