Abstract
L’architettura molecolare alla base dei diversi sistemi di determinazione sessuale dei vertebrati rimane in gran parte elusiva, nonostante le evidenze frammentarie di cambiamenti nei regolatori a monte e nei mediatori a valle. In questo studio sono state modellate le reti regolatorie specie-specifiche dello sviluppo urogenitale e gonadico in due tartarughe caratterizzate da meccanismi di determinazione sessuale differenti: Apalone spinifera, con determinazione sessuale genotipica ZZ/ZW (GSD), e Chrysemys picta, con determinazione sessuale dipendente dalla temperatura (TSD), utilizzando dati comparabili raccolti durante diverse fasi dello sviluppo embrionale.
Sono stati identificati alcuni passaggi chiave nella transizione evolutiva dei meccanismi di determinazione sessuale, verificando quali componenti modulari delle reti siano conservati e quali siano invece divergenti. In particolare, sono state testate diverse ipotesi riguardanti la conservazione dei fattori di trascrizione (TF) che agiscono come nodi centrali della rete e dei loro geni bersaglio, il reclutamento di nuovi bersagli da parte di TF conservati, la sostituzione di un TF ancestrale con un nuovo regolatore e il completo rinnovamento di specifici moduli della rete.
I risultati indicano un possibile ruolo delle ciglia primarie come integratori dei segnali ambientali alla base della TSD. Diversi componenti già noti per essere sensibili alla temperatura durante la determinazione sessuale, tra cui i sistemi calcio-redox, pSTAT3, Wnt/RSPO1/β-catenina e DHH, risultano infatti associati alle ciglia primarie. Inoltre, i fattori di trascrizione che hanno mostrato cambiamenti evolutivi tra le due specie regolano anch’essi componenti legati alle ciglia primarie, suggerendo modificazioni della loro capacità sensoriale durante la transizione tra TSD e GSD.
In Chrysemys questi cambiamenti sembrano riguardare soprattutto canali del calcio e degli ioni e componenti del trasporto di membrana, mentre in Apalone interessano maggiormente elementi strutturali e processi di ciliogenesi. Gli autori propongono quindi una nuova ipotesi di integrazione delle ciglia primarie, che amplia gli attuali modelli di regolazione epigenetica dello sviluppo sessuale delle tartarughe e contribuisce a interpretare l’evoluzione della plasticità e della canalizzazione dello sviluppo. L’ipotesi necessita tuttavia di una verifica sperimentale funzionale.
Sviluppo dello studio
La determinazione sessuale nei vertebrati rappresenta uno degli esempi più interessanti di come sistemi biologici profondamente diversi possano utilizzare, almeno in parte, gli stessi elementi molecolari. Nei rettili, e in particolare nelle tartarughe, questa diversità è particolarmente evidente: alcune specie determinano il sesso attraverso cromosomi sessuali, mentre altre utilizzano segnali ambientali, come la temperatura di incubazione. Esistono inoltre sistemi intermedi o particolarmente complessi nei quali la componente genetica e quella ambientale interagiscono. I geni coinvolti nello sviluppo sessuale possono quindi essere conservati per milioni di anni, mentre cambiano la loro posizione all’interno delle reti regolatorie, i loro bersagli e il modo in cui vengono attivati.
Lo studio di Gessler e colleghi affronta proprio questa questione mettendo a confronto due specie di tartarughe filogeneticamente distanti ma particolarmente informative per comprendere l’evoluzione della determinazione sessuale: la tartaruga palustre dipinta Chrysemys picta, rappresentativa della determinazione sessuale dipendente dalla temperatura, e la tartaruga dal guscio molle Apalone spinifera, caratterizzata da un sistema genotipico ZZ/ZW. Le due linee evolutive si sono separate circa 175 milioni di anni fa, offrendo quindi l’opportunità di osservare quali elementi della regolazione dello sviluppo sessuale siano rimasti conservati e quali siano stati modificati nel corso dell’evoluzione.
Per ricostruire queste differenze, gli autori hanno combinato dati di espressione genica, informazioni sui siti di legame dei fattori di trascrizione e dati sulle interazioni tra proteine. Attraverso l’algoritmo PANDA hanno costruito reti gene–fattore di trascrizione relative a differenti condizioni di temperatura, sesso e stadio embrionale. Per Chrysemys sono state considerate temperature associate alla produzione di maschi e femmine, rispettivamente 26 °C e 31 °C; per Apalone, invece, sono state analizzate entrambe le temperature per entrambi i sessi, dal momento che il sesso di questa specie è determinato geneticamente. Il campionamento comprendeva cinque stadi dello sviluppo, dalle fasi precedenti al periodo termicamente sensibile fino alle fasi centrali e tardive della differenziazione sessuale.
L’analisi ha evidenziato una situazione particolarmente interessante. Dei 148 fattori di trascrizione presenti nelle reti complete, 89 erano espressi in entrambe le specie e potevano quindi essere utilizzati per il confronto evolutivo. Di questi, 50 mostravano una sostanziale conservazione dei loro bersagli, mentre 39 presentavano una divergenza significativa nei geni regolati o nella forza delle loro interazioni. Questo risultato suggerisce che l’evoluzione della determinazione sessuale non dipenda necessariamente dalla sostituzione dei principali regolatori, ma possa avvenire anche attraverso un processo di riscrittura dei loro bersagli. Un fattore di trascrizione può quindi rimanere presente e continuare ad agire come nodo centrale della rete, ma controllare nel tempo un insieme differente di geni.
Cinque fattori — ARID3B, EMX2, LHX9, LIN54 e MEOX2 — hanno fornito risultati sufficientemente completi da consentire un’analisi più approfondita. ARID3B rappresenta un caso compatibile con il cosiddetto developmental systems drift: i geni bersaglio sono cambiati tra le specie, ma le funzioni associate sono rimaste sostanzialmente conservate. Gli altri quattro fattori, invece, hanno mostrato cambiamenti sia nei bersagli sia nelle loro annotazioni funzionali, suggerendo una possibile acquisizione di nuove funzioni durante l’evoluzione. È importante sottolineare che gli autori interpretano questi risultati come ipotesi evolutive da sottoporre a validazione funzionale, non come dimostrazione definitiva di un nuovo ruolo per questi geni.
È proprio a questo punto che emerge il risultato più innovativo dello studio. Molti dei fattori di trascrizione che mostrano differenze tra le due specie sono associati alle ciglia primarie, organelli presenti nella maggior parte dei tipi cellulari e capaci di percepire e integrare segnali provenienti dall’ambiente o da altre vie intracellulari. Diciannove fattori hanno restituito annotazioni funzionali legate alle ciglia primarie. Tra questi figurano ARID3B, EMX2, LHX9, LIN54 e MEOX2, ma anche DLX2, HIC2, HMBOX1, HOXD3, LHX2, MSX1, NFIA, RFX4, SHOX, SHOX2, SMAD4, SOX10 e ZEB1. Alcuni di questi fattori sono già noti per il loro coinvolgimento nello sviluppo gonadico.
Le ciglia primarie sono particolarmente interessanti in questo contesto perché la loro membrana può contenere canali sensibili a diversi stimoli, compresa la temperatura, e perché costituiscono piattaforme attraverso cui possono essere integrate numerose vie di segnalazione. Tra queste rientrano le vie Hedgehog e Wnt, entrambe già associate allo sviluppo gonadico, oltre a sistemi di segnalazione coinvolti nella risposta cellulare a stimoli ambientali. I risultati dello studio suggeriscono quindi che le ciglia primarie potrebbero rappresentare un punto di collegamento tra la temperatura dell’ambiente e le modificazioni molecolari che indirizzano lo sviluppo della gonade.
Da questa convergenza di risultati nasce la Primary Cilia Integration hypothesis, o ipotesi di integrazione delle ciglia primarie. Il modello proposto dagli autori amplia il precedente modello calcio-redox della determinazione sessuale dipendente dalla temperatura. In questa interpretazione, le variazioni termiche potrebbero influenzare canali TRP presenti nelle ciglia primarie, modificando l’ingresso di Ca²⁺ e innescando una serie di segnali intracellulari. Il calcio potrebbe interagire con i processi redox mitocondriali e con vie come STAT3, Wnt/β-catenina e Hedgehog, tutte potenzialmente collegate alla regolazione dello sviluppo sessuale.
Un possibile collegamento riguarda anche la regolazione epigenetica. Secondo il modello discusso dagli autori, a temperature più basse la maggiore attività di KDM6B può favorire la demetilazione di H3K27me3 nel promotore di Dmrt1, facilitando l’attivazione dei geni associati allo sviluppo maschile. A temperature più elevate, la fosforilazione di STAT3 potrebbe invece reprimere Kdm6b, mentre pSTAT3 può contribuire all’attivazione di Foxl2 e quindi della via femminile. Il segnale termico, in questa prospettiva, non agirebbe quindi direttamente su un singolo “gene della temperatura”, ma attraverso una rete di interazioni che collega percezione ambientale, metabolismo cellulare, segnalazione e regolazione epigenetica.
Il confronto tra le due specie suggerisce inoltre che la transizione evolutiva tra TSD e GSD possa essere stata accompagnata da una diversa organizzazione della componente sensoriale delle ciglia. In Chrysemys emergono maggiormente elementi associati a canali ionici, calcio e trasporto di membrana, coerenti con un sistema nel quale la temperatura deve essere percepita e tradotta in una risposta dello sviluppo. In Apalone, invece, risultano più evidenti elementi strutturali e legati alla ciliogenesi. Questa differenza potrebbe riflettere un processo di canalizzazione dello sviluppo: quando il sesso non dipende più dalla temperatura, alcune componenti della rete potrebbero essere state progressivamente riorganizzate o liberate dalla loro precedente funzione termica.
Anche altri risultati rafforzano questa interpretazione. L’analisi qualitativa ha individuato possibili cambiamenti nella regolazione di Dhh, un gene coinvolto nello sviluppo gonadico, che potrebbero contribuire alla diversa espressione osservata tra Apalone e Chrysemys. Inoltre, alcuni fattori di trascrizione già studiati nel contesto dello sviluppo sessuale dei mammiferi emergono qui come potenziali componenti della regolazione della determinazione sessuale nei rettili. Gli autori sottolineano tuttavia che si tratta di candidati da verificare sperimentalmente.
Il modello proposto non deve quindi essere considerato una dimostrazione definitiva del ruolo delle ciglia primarie nella TSD. Gli stessi autori evidenziano che il dataset presenta limitazioni, tra cui il numero ridotto di campioni e il pooling dell’espressione genica attraverso più stadi dello sviluppo. Per questo motivo, le differenze individuate rappresentano soprattutto segnali sufficientemente forti da emergere nonostante i limiti del campionamento. La fase successiva sarà verificare direttamente se le ciglia primarie siano effettivamente necessarie per percepire la temperatura e per trasmettere quel segnale alle vie molecolari che determinano il destino sessuale della gonade.
Conclusioni
Lo studio propone un nuovo modo di interpretare l’evoluzione della determinazione sessuale nelle tartarughe. Il confronto tra Chrysemys picta e Apalone spinifera mostra che molti fattori di trascrizione possono rimanere conservati mentre cambiano in modo sostanziale i geni che essi regolano. In alcuni casi questo riorientamento mantiene funzioni ancestrali; in altri sembra associarsi all’acquisizione di nuove funzioni, offrendo un possibile esempio di come il developmental systems drift e la selezione possano modificare le reti dello sviluppo.
Il risultato più rilevante è però l’ampia convergenza tra fattori di trascrizione coinvolti nella divergenza evolutiva e componenti delle ciglia primarie. Gli autori propongono perciò che queste strutture possano agire come sentinelle dei segnali ambientali nella determinazione sessuale dipendente dalla temperatura, collegando la percezione dell’ambiente alla regolazione delle vie molecolari dello sviluppo. L’ipotesi amplia il modello calcio-redox esistente e suggerisce un possibile ruolo delle ciglia anche nella transizione evolutiva tra sistemi TSD e GSD.
Si tratta tuttavia di un modello ancora da verificare. Gli autori indicano come prossimo passo particolarmente importante il confronto proteomico delle ciglia primarie durante lo sviluppo gonadico di specie TSD e GSD, insieme ad approcci sperimentali che permettano di stabilire il ruolo effettivo dei singoli fattori candidati. Solo attraverso queste verifiche sarà possibile capire se le ciglia primarie costituiscano realmente uno dei meccanismi attraverso cui l’ambiente può influenzare l’evoluzione dei sistemi di determinazione sessuale.
Credit foto in evidenza: Hayden Lewis
